Istnieją dwa rodzaje mikroskopów fluorescencyjnych pod względem drogi optycznej
1. Transmisyjny mikroskop fluorescencyjny: Źródło światła wzbudzającego przechodzi przez materiał próbki przez soczewkę kondensora w celu wzbudzenia fluorescencji. Powszechnie stosuje się kolektor ciemnego pola, a zwykłego kolektora można również użyć do ustawienia lustra w taki sposób, aby światło wzbudzenia zostało przekierowane i ominięte do preparatu. To jest starszy mikroskop fluorescencyjny. Zaletą jest to, że fluorescencja jest silna przy małym powiększeniu, ale wadą jest to, że fluorescencja zmniejsza się wraz ze wzrostem powiększenia. Dlatego lepiej jest obserwować większe próbki materiałów.
2. Mikroskop epifluorescencyjny to nowy typ mikroskopu fluorescencyjnego opracowany w czasach nowożytnych. Różnica polega na tym, że światło wzbudzenia pada z soczewki obiektywu na powierzchnię próbki, to znaczy ta sama soczewka obiektywu jest używana jako kondensator oświetlenia i soczewka obiektywu do zbierania fluorescencji. Dichroiczny rozdzielacz wiązki należy dodać na ścieżce światła, która jest oddalona o 45 stopni od lekkiego uranu. Światło wzbudzenia jest odbijane do soczewki obiektywu i zbierane na próbce. Fluorescencja generowana przez próbkę i światło wzbudzenia odbite przez powierzchnię soczewki obiektywu i powierzchnię szkła nakrywkowego wchodzą jednocześnie do soczewki obiektywu i wracają do dwukolorowego rozdzielacza wiązki, aby światło wzbudzenia było oddzielone od fluorescencji resztkowe światło wzbudzenia jest pochłaniane przez filtry blokujące. Takie jak zmiana na kombinację różnych filtrów wzbudzenia / dwukolorowego rozdzielacza wiązki / filtra blokującego, może zaspokoić potrzeby różnych produktów reakcji fluorescencyjnych. Zaletą tego rodzaju mikroskopu fluorescencyjnego jest to, że oświetlenie pola widzenia jest równomierne, obraz jest wyraźny, a im większe powiększenie, tym silniejsza fluorescencja.
