Dwa powszechnie stosowane podejścia do obserwacji w mikroskopach
1, Obserwacja ciemnego pola
Ciemne pole widzenia to w rzeczywistości oświetlenie ciemnego pola. Jego charakterystyka różni się od jasnego pola widzenia, ponieważ nie obserwuje bezpośrednio oświetlającego światła, ale raczej obserwuje odbite lub ugięte światło kontrolowanego obiektu. Dlatego pole widzenia staje się ciemnym tłem, podczas gdy sprawdzany obiekt przedstawia jasny obraz
Zasada ciemnego pola opiera się na optycznym zjawisku Tyndalla, w którym cząsteczki kurzu nie mogą być zaobserwowane przez ludzkie oko pod wpływem silnego światła z powodu dyfrakcji spowodowanej przez silne światło. Jeśli światło jest rzucane na nie pod kątem, cząsteczki wydają się zwiększać swoją objętość w wyniku odbicia światła, dzięki czemu są widoczne dla ludzkiego oka.
Specjalnym akcesorium niezbędnym do obserwacji w ciemnym polu jest reflektor ciemnego pola. Jego cechą charakterystyczną jest to, że nie pozwala wiązce światła na przejście przez obiekt od dołu do góry, ale zmienia drogę światła na ukośną w stronę obiektu, dzięki czemu światło oświetlające nie wchodzi bezpośrednio do obiektywu, a wykorzystuje jasny obraz utworzony przez odbicie lub dyfrakcję światła na powierzchni kontrolowanego obiektu. Rozdzielczość obserwacji w ciemnym polu jest znacznie wyższa niż w przypadku obserwacji w jasnym polu i sięga do 0,02-0,004
2, Metoda kontroli lustra kontrastu fazowego
Udany wynalazek mikroskopii z kontrastem fazowym w rozwoju mikroskopów optycznych jest ważnym osiągnięciem współczesnej technologii mikroskopii. Wiemy, że ludzkie oko potrafi rozróżnić jedynie długość fali (kolor) i amplitudę (jasność) fal świetlnych. W przypadku bezbarwnych i przezroczystych próbek biologicznych, gdy światło przechodzi, długość fali i amplituda nie zmieniają się zbytnio, co utrudnia obserwację preparatu w jasnym polu
Mikroskop z kontrastem fazowym wykorzystuje różnicę w długości ścieżki optycznej badanego obiektu do kontroli lustrzanej, skutecznie wykorzystując zjawisko interferencji światła do przekształcenia różnicy faz, której ludzkie oko nie może rozróżnić, w zauważalną różnicę amplitudy. Nawet substancje bezbarwne i przezroczyste mogą stać się wyraźnie widoczne. To znacznie ułatwia obserwację żywych komórek, dlatego mikroskopia z kontrastem fazowym jest szeroko stosowana w mikroskopach odwróconych
Podstawową zasadą mikroskopii z kontrastem fazowym jest przekształcenie różnicy ścieżki optycznej światła widzialnego przechodzącego przez próbkę na różnicę amplitudy, poprawiając w ten sposób kontrast pomiędzy różnymi strukturami i czyniąc je wyraźnymi i widocznymi. Po przejściu przez próbkę światło ulega załamaniu, odbiegając od pierwotnej ścieżki optycznej i opóźniając się o 1/4 λ (długość fali). Jeśli różnica dróg optycznych zostanie zwiększona lub zmniejszona o kolejną 1/4 λ, różnica dróg optycznych wyniesie 1/2 λ, a interferencja między dwiema wiązkami światła wzrośnie lub spadnie po połączeniu osi, poprawiając kontrast. Pod względem struktury mikroskopy z kontrastem fazowym mają dwie szczególne różnice w porównaniu ze zwykłymi mikroskopami optycznymi:
1. Pomiędzy źródłem światła a kondensatorem znajduje się pierścieniowa przysłona, której zadaniem jest utworzenie pustego w środku stożka światła, które przechodzi przez kondensor i skupia się na preparacie
2. Kątowa płytka fazowa: Do soczewki obiektywu dodawana jest płytka fazowa pokryta fluorkiem magnezu, która może opóźniać fazę światła bezpośredniego lub ugiętego o 1/4 λ. Można go podzielić na dwa typy:
(1) . Płytka fazowa A+: Opóźnij światło bezpośrednie o 1/4 λ i dodaj dwa zestawy fal świetlnych po połączeniu osi. Amplituda wzrasta, a struktura próbki staje się jaśniejsza niż otaczające medium, tworząc jasny kontrast (lub kontrast ujemny)
(2) . Płytka fazowa B+: Opóźnij ugięte światło o 1/4 λ i odejmij fale świetlne po połączeniu osi dwóch zestawów promieni świetlnych, co skutkuje zmniejszeniem amplitudy i utworzeniem ciemnego kontrastu (lub kontrastu dodatniego). Struktura staje się ciemniejsza niż otaczające medium
