Dlaczego potrzebujemy mikroskopu konfokalnego?
1. Po wysiłkach i ulepszeniach naszych wielkich poprzedników, mikroskop optyczny osiągnął doskonały poziom. Tak naprawdę zwykłe mikroskopy mogą w prosty i szybki sposób dostarczyć nam pięknych obrazów mikroskopowych. Jednakże nastąpiło wydarzenie, które wniosło rewolucyjną innowację do tego niemal doskonałego świata mikroskopów, a było wynalezieniem „laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego”. Cechą charakterystyczną tego nowego typu mikroskopu jest zastosowanie układu optycznego, który wyodrębnia informacje o obrazie jedynie z powierzchni, na której skupia się ostrość. Zmieniając ostrość przy jednoczesnym przywracaniu uzyskanych informacji w pamięci obrazu, można uzyskać żywy obraz z pełną trójwymiarową inteligencją informacyjną. Dzięki tej metodzie można łatwo uzyskać informacje o kształcie powierzchni, których nie można potwierdzić za pomocą konwencjonalnych mikroskopów. Dodatkowo dla typowych mikroskopów optycznych „poprawa rozdzielczości” i „pogłębienie głębi ogniskowej” to warunki sprzeczne, zwłaszcza przy dużych powiększeniach. Jednak w mikroskopach konfokalnych problem ten można łatwo rozwiązać.
2. Zalety konfokalnych układów optycznych
Schemat ideowy laserowego mikroskopu konfokalnego
Do oświetlania próbki punktami wykorzystuje się konfokalny układ optyczny, natomiast odbite światło odbierane jest także przez czujnik punktowy. Po umieszczeniu próbki w ognisku prawie całe odbite światło może dotrzeć do urządzenia światłoczułego. Gdy próbka odbiega od punktu ogniskowego, odbite światło nie może dotrzeć do urządzenia światłoczułego. Oznacza to, że w konfokalnym układzie optycznym wysyłane będą tylko obrazy pokrywające się z ogniskiem, a plamka świetlna i niepotrzebne rozproszone światło będą ekranowane.
Dlaczego warto używać lasera?
W konfokalnym układzie optycznym próbka jest oświetlana, a odbite światło jest również odbierane przez czujnik punktowy. Niezbędne stają się zatem punktowe źródła światła. Laser jest bardzo punktowym źródłem światła. W większości przypadków źródłem światła mikroskopu konfokalnego jest źródło światła laserowego. Ponadto monochromatyczność, kierunkowość i doskonały kształt wiązki laserów są również ważnymi powodami ich powszechnego zastosowania.
4. Możliwa staje się obserwacja w czasie rzeczywistym w oparciu o szybkie skanowanie
Skanowanie laserowe wykorzystuje deflektor akustyczny (AO prime) w kierunku poziomym i lustro Servo Galvano w kierunku pionowym. Ze względu na brak wibracji mechanicznych w optycznym zespole polaryzacji audio możliwe jest szybkie skanowanie i obserwacja w czasie rzeczywistym na ekranie monitorującym. Szybki charakter tego typu aparatu jest bardzo ważnym elementem, który bezpośrednio wpływa na szybkość ustawiania ostrości i wyszukiwania pozycji.
5. Zależność położenia ogniska od jasności
W konfokalnym układzie optycznym jasność próbki jest wysoka, gdy jest ona prawidłowo umieszczona w pozycji ogniskowej, a jej jasność gwałtownie maleje przed i za nią (linia ciągła na rys. 4). Wrażliwa selektywność tej płaszczyzny ogniskowej jest właśnie zasadą wyznaczania kierunku wysokości i rozszerzania głębokości ogniskowej w mikroskopii konfokalnej. W porównaniu z tym typowe mikroskopy optyczne nie wykazują znaczących zmian jasności przed i po położeniu ogniskowej (linia przerywana na rysunku 4).
6. Wysoki kontrast i rozdzielczość
Zwykle w mikroskopach optycznych pojawia się światło odbite odbiegające od ogniska
