Różnice i cechy charakterystyczne między mikroskopami fluorescencyjnymi a zwykłymi mikroskopami optycznymi
Mikroskop fluorescencyjny różni się od zwykłego mikroskopu optycznego tym, że nie obserwuje próbek przy oświetleniu zwykłymi źródłami światła. Zamiast tego wykorzystuje pewną długość fali światła (zwykle światło ultrafioletowe, światło niebieskofioletowe) do wzbudzenia substancji fluorescencyjnych wewnątrz próbki pod mikroskopem, powodując emisję fluorescencji. Dlatego rolą źródła światła w mikroskopie fluorescencyjnym nie jest bezpośrednie oświetlenie, ale źródło energii wzbudzające substancje fluorescencyjne wewnątrz próbki. Powodem, dla którego możemy obserwować próbki, nie jest oświetlenie źródła światła, ale zjawisko fluorescencji wykazywane przez substancje fluorescencyjne znajdujące się wewnątrz próbki po pochłonięciu wzbudzonej energii świetlnej. Z tego widać, że cechą mikroskopii fluorescencyjnej jest przede wszystkim to, że jej źródło światła może dostarczyć dużą ilość światła wzbudzającego w określonym zakresie długości fal, dzięki czemu substancje fluorescencyjne w próbce mogą uzyskać niezbędne natężenie światła wzbudzającego. Jednocześnie mikroskopy fluorescencyjne muszą mieć odpowiednie systemy filtrów. Mikroskop fluorescencyjny jest podstawowym narzędziem w fluorescencyjnej chemii tkanek. Składa się z głównych elementów, takich jak źródło światła o ultra-wysokim napięciu, system filtrów (w tym płytki filtrów wzbudzających i tłumiących), układ optyczny i system fotograficzny. Wykorzystuje światło o określonej długości fali do wzbudzenia próbki i emisji fluorescencji.
1. Metody wzbudzania fluorescencji: W zależności od zakresu długości fal światła rozróżnia się metodę wzbudzania UV (przy użyciu oświetlenia ultrafioletowego) i metodę wzbudzania BV (przy użyciu światła niebiesko-fioletowego). Metoda wzbudzenia UV wykorzystuje do wzbudzenia światło bliskie ultrafioletowi o długości mniejszej niż 400 nm. W metodzie tej nie stosuje się widzialnego światła wzbudzającego, więc obserwowana fluorescencja wykazuje naturalną fluorescencję barwnika, co ułatwia odróżnienie specyficznej fluorescencji na próbce od samofluorescencji tkanki tła.
2. Metoda wzbudzenia BV: Polega na wzbudzeniu od ultrafioletu do światła niebieskiego skupionego przy 404 nm i 434 nm. W tej metodzie do napromieniania próbki wykorzystuje się światło niebieskie, dlatego-filtr odcinający systemu obserwacji fluorescencji musi wykorzystywać filtr, który może całkowicie blokować światło niebieskie i całkowicie przepuszczać wymaganą fluorescencję zieloną i żółtą. Pigmenty fluorescencyjne stosowane w metodzie fluorescencyjnej przeciwciał. Długość fali maksymalnej absorpcji światła wzbudzenia i długość fali maksymalnej emisji fluorescencji są stosunkowo bliskie, dlatego filtr stosowany w metodzie wzbudzenia BV musi wykorzystywać filtr o ostrym odcięciu. W metodzie tej można wykorzystać światło niebieskie jako światło wzbudzające, dzięki czemu skuteczność absorpcji pigmentów fluorescencyjnych jest wysoka i można uzyskać jaśniejsze obrazy. Wadą jest to, że fluorescencja poniżej 500 nm nie jest widoczna, natomiast fluorescencja powyżej 500 nm powoduje, że cały obraz wydaje się żółty. W metodzie z przeciwciałami fluorescencyjnymi o specyficzności decyduje głównie kolor charakterystyczny dla pigmentów fluorescencyjnych, dlatego też przy omawianiu subtelnej specyficzności, wspomniane powyżej wady metody wzbudzenia BV często mają znaczący wpływ.
